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Haemolysis as influence and interference factor deutsch

  

H�molyse als Einflu�gr��eund St�rfaktor

Prof. Dr. L. Thomas, Kirschbaumweg 8, 60489 Frankfurt, Deutschland
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Einleitung

Die H�molyse ist eine nicht zu vernachl�ssigende Einflu�gr��e und ein wichtiger St�rfaktor mit Bedeutung auf den Laborbefund. Aufgrund der mechanisierten Analytik und nun auch der zunehmenden Automatisierung der pr�analytischen Phase ger�t die Pr�fung des Untersuchungsmaterials auf H�molyse zunehmend in Vergessenheit. Insbesondere im ambulanten Bereich gehen Vollblutproben aufgrund der zunehmenden Konzentrierung der Laboratoriumsdiagnostik auf eine immer l�ngere Reise. Die Folge ist eine Zunahme h�molytischer Proben, bei denen, auch wenn sie visuell nicht h�molytisch sind, schon ein Austritt intrazellul�rer Bestandteile in das Plasma/Serum erfolgt sein kann.

Handelt es sich dabei um Proben von Patienten mit h�molytischem Syndrom (in vivo-H�molyse) ist im Labor kaum noch eine Abgrenzung von der in vitro-H�molyse, die meist aus einer unsachgem��en Blutentnahme resultiert, m�glich.

Die Folge sind meist falsch hohe, weniger falsch niedrige Analysenergebnisse oder unvermutet pathologische Werte von z. B. Kalium, LDH, AST, saurer Phosphatase, Neuronspezifischer Enolase.

Zielsetzung dieses Beitrages ist es, auf das Ausma� h�molytischer St�rungen auf den Laborbefund hinzuweisen und somit die Anzahl unsachgem��er Blutentnahmen zu vermindern.

H�molyse

H�molyse ist die Freisetzung intrazellul�rer Bestandteile aus Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in die extrazellul�re Fl�ssigkeit, z. B. in das Plasma oder Serum /1/. Visuell wird die H�molyse nach Zentrifugation der Probe an einer Rotf�rbung von Plasma oder Serum erkannt. Die Angaben ab welcher Konzentration freies H�moglobin als Rotf�rbung von Plasma oder Serum erkennbar ist, schwanken in der Literatur zwischen 100 und 300 mg/l.

H�molyse kann zu Ver�nderungen einer bestimmten Me�gr��e im Untersuchungsgut f�hren. Sie ist eine Einflu�gr��e, wenn die Freisetzung der Blutzellbestandteile in vivo, als intravasal erfolgte. Die H�molyse ist ein St�rfaktor, wenn sie nach der Probennahme geschieht und das Untersuchungsergebnis ver�ndert /2/.

Thrombozytolyse und Granulozytolyse k�nnen auch ohne visuelle H�molyse das Untersuchungsergebnis beeinflussen /3/. So ist die Thrombozytolyse beim Gerinnungsvorgang verantwortlich f�r die h�here Konzentration intrazellul�rer Bestandteile im Plasma gegen�ber dem Serum. Auch f�hrt ein intravasaler Leukozytenzerfall z. B. zu einer Lysozymerh�hung bei myeloischen und monozyt�ren Leuk�mien.

Ursachen der H�molyse

Bei der visuellen pr�analytischen Inspektion zentrifugierter Blutproben ist in etwa 60% der F�lle eine H�molyse die Ursache der Zur�ckweisung von Proben. In einer Studie /4/ zeigten 3,3% der f�r klinisch-chemische Untersuchungen ins Labor gesendeten Proben eine H�molyse. Bei Abkl�rung der Ursache waren nur 3,2% der h�molytischen Proben durch eine in vivo-H�molyse bedingt.

In vitro-H�molyse

Die wesentlichen Fehler, die eine in vitro-H�molyse bewirken, werden bei der Probennahme gemacht (Tab. 1). Weitere Fehlerm�glichkeiten sind in Tab. 2 aufgef�hrt.

 

 

Tab. 1: H�ufige Probennahme-bedingte H�molysen /4/

 

  • Zu starke Aspiration, insbesondere, wenn oberfl�chliche Venen punktiert werden. Dabei soll die Aspiration vermittels d�nner Nadeln weniger H�molyse verursachen als durch weitlumige, da dann die Flu�rate gering und somit die Flie�geschwindigkeit, Turbulenz und H�molyse klein sein sollen /5/.

  • Partielle Obstruktion eines ven�sen oder arteriellen Katheters. Das hat eine verst�rkte Aspiration zur Folge, wenn die Probennahme mit einer Spritze erfolgt.

  • Probennahme mit einer Spritze und anschlie�ender Aufteilung der Probe auf mehrere Probenr�hrchen. 

     

 

 

 

Tab. 2: H�ufige Ursachen f�r H�molyse nach Probennahme

 

  • Kr�ftiges Sch�tteln des Blutes

  • Zentrifugation des Blutes vor kompletter Gerinnung

  • Zentrifugation teilgeronnener Proben von antikoagulierten Patienten

  • Erzeugung von Unter- oder �berdruck im Probenr�hrchen

  • Verd�nnung des Blutes mit hypotoner L�sung

  • Einfrieren und Auftauen von Vollblut

  • Lagerung oder Transport von Vollblut �ber mehrere Tage bei Raumtemperatur /6/ 

     

In vivo-H�molyse

Die in vivo-H�molyse ist bevorzugt durch Antik�rper, biochemisch durch Pharmaka oder toxische Substanzen, heredit�rer (z. B. H�moglobinopathie, Enzymdefekt, Sph�rozytose) oder infekti�s (z.B. Malaria) bedingt. Bei Verdacht auf in vivo-H�molyse sollte Plasma untersucht werden, um eine zus�tzliche in vitro-H�molyse auszuschlie�en /1/.

Erkennung von H�molys

Visuell ist eine H�molyse in nicht ikterischen Proben an einer Rotf�rbung von Serum und Plasma sicher erkennbar, wenn die Konzentration des freien H�moglobins �ber 300 mg/l betr�gt /3/. ie Quantifizierung des freien H�moglobins unterhalb dieser Konzentration erfolgt immunnephelometrisch /7/ oder spektometrisch mit einer Zweiwellenl�ngenmethode (z.B. ACA). Die oberen Grenzwerte f�r Plasma sind 20 mg/l, f�r Serum 50 mg/l.

Ver�nderungen im Plasma/Serum durch H�molyse

Aus Blutzellen freigesetzte Bestandteile, deren Konzentration intrazellul�r mehr als 10fach h�her als extrazellul�r ist, k�nnen im Plasma/Serum bei in vivo- und in vitro-H�molyse deutlich ansteigen.  Das betrifft insbesondere Kalium, LDH und die AST. Me�gr��en, die im Serum h�her gemessen werden als im Plasma, entstammen den Thrombozyten, z. B. Kalium, Neuron-spezifische Enolase, saure Phosphatase. Die indikatoren f�r das Vorliegen einer H�molyse sind in Tab. 3 aufgef�hrt.

 

Tab. 3: Indikatoren f�r H�molyse
  • Rotf�rbung von Plasma oder Serum

  • Unerwartete Erh�hung von Kalium, LDH, AST, saurer Phosphatase, Neuron-spezifischer

  • Enolase

  • Erniedrigung von Haptoglobin

  • Anstieg des indirekten Bilirubins

  • Erh�hung des Retikulozytenindex H�molysen /4/ 

     

  • Zu starke Aspiration, insbesondere, wenn oberfl�chliche Venen

  • punktiert werden. Dabei soll die Aspiration vermittels d�nner Nadeln weniger H�molyse verursachen als durch weitlumige, da dann die Flu�rate gering und somit die Flie�geschwindigkeit, Turbulenz und H�molyse klein sein sollen /5/.

  • Partielle Obstruktion eines ven�sen oder arteriellen Katheters. Das hat eine verst�rkte Aspiration zur Folge, wenn die Probennahme mit einer Spritze erfolgt.

  • Probennahme mit einer Spritze und anschlie�ender Aufteilung der Probe auf mehrere Probenr�hrchen. 

     

Differenzierung von in vivo- und in vitro-H�molyse

 Wenn auch die in vitro-H�molyse ungleich h�ufiger ist als die in vivo- Form, ist die Feststellung letzterer klinisch bedeutsam, da sie pathologischen Ursprungs ist und die zu bestimmenden Me�gr��en f�r Diagnose, Verlauf und Therapie einer Erkrankung relevant sind. Ein Zur�ckweisen der Probe oder von Analysenanforderungen wie bei der sicher festgestellten in vitro-H�molyse ist medizinisch nicht sinnvoll. Deshalb mu� eine Unterscheidung der H�molyseform durchgef�hrt werden.

 In vivo freigesetztes H�moglobin wird von Haptoglobin gebunden und in das retikuloendotheliale System, bevorzugt der Milz, transportiert. Freies H�moglobin ist im Plasma erst me�bar, wenn die Transportkapazit�t des Haptoglobins ersch�pft ist. Es ist dann kein Haptoglobin mit immunnephelometrischen oder immunturbidimetrischen Methoden me�bar. Im Referenzbereich liegende Haptoglobinkonzentrationen k�nnen gemessen werden bei gleichzeitigem Vorliegen einer Akute-Phase-Reaktion (CRP erh�ht) und bei Patienten mit Hypersplenismus. Hyperhaptoglobin�mien bei Erh�hung von freiem H�moglobin im Plasma und H�moglobinurie sind beim Plasmozytom beschrieben /8/. Beim HELLP-Syndrom kann zum Zeitpunkt der Diagnosestellungdie Haptoglobinkonzentration im Plasma noch normal sein, f�llt aber innerhalb der darauffolgenden 10 Tage ab /9/.

Bei Verdacht auf ein h�molytisches Syndrom sind der Abfall des Haptoglobins und der Anstieg von LDH, des indirekten Bilirubins und des Retikulozytenindex abh�ngig vom Ausma� der H�molyse. W�hrend bei ausgepr�gter H�molyse Ver�nderungen von LDH, indirektem Bilirubin und Haptoglobin innerhalb von 24 h auftreten k�nnen, erfolgt der Anstieg des Retikulozytenindex fr�hestens nach 2 Tagen. Eine Erh�hung des indirekten Bilirubins tritt erst auf, wenn die H�molyserate, die normalerweise 0,8% betr�gt, auf �ber 5% gesteigert ist. Eine LDH-Erh�hung, die eine Verschiebung des LDH-Musters mit guter Nachweisbarkeit von LDH1 und LDb verursacht, wird bei intravasaler H�molyse erst gefunden, wenn der Retikulozytenindex gr��er als 10% ist. Bei einer LDH-Aktivit�t von 165 U/l, bewirkt eine in vitro-H�molyse, die ein freies H�moglobin von 800 mg/l im Serum verursacht, einen gleichzeitigen LDH-Anstieg von 58% /10/. Massive intravasale
H�molysen mit einem Abfall des H�matokrits um mehr als ein Viertel innerhalb von 12 h f�hren zu einer Hypertriglyzerid�mie. Ein verminderter Triglyzeridmetabolismus, bedingt durch eine reduzierte Mikrozirkulation und/oder die Mobilisation freier Fetts�uren und deren Reesterifizierung zu Triglyzeriden sollen die Ursache sein /11/.

Kriterien zur Unterscheidung von in vivo- und in vitro-H�molyse sind in Tab. 4 aufgef�hrt.

 

Tab. 4: Differenzierung der H�molyseformen /1/
In vitro-H�molyse
  • Parallele Erh�hung von H�moglobin (Rotf�rbung von Plasma/Serum), Kalium, LDH, AST, aber Haptoglobin und Retikulozytenindex normal.

  • Unerwartete Erh�hung von Kalium, aber keine Rotf�rbung von Plasma/Serum; LDH im Referenzbereich. Tritt z. B. auf bei mehrt�giger Lagerung von Vollblut.

In vivo-H�molyse
  • Parallele Erh�hung von H�moglobin (Rotf�rbung von Plasma/Serum) und LDH ohne parallelen Anstieg von Kalium.

  • Keine Rotf�rbung von Plasma/Serum, aber Erniedrigung von Haptoglobin und eventuell Erh�hung von LDH, von indirektem Bilirubin und/-oder des Retikulozytenindex.

  • Keine Rotf�rbung des Serums, aber Erh�hung von LDH, Kalium und saurer Phosphatase. Im Plasma kein Anstieg dieser Me�gr��en. Tritt z. B. auf bei Zust�nden mit Thrombozytose

 

H�molyse als St�rfaktor

  • Aus Blutzellen in das Plasma/Serum freigesetzte Substanzen k�nnen aus folgenden Gr�nden zur Ver�nderung einer zu bestimmenden Me�gr��e f�hren:

  • Erh�hung oder Verminderung der Konzentration der Me�gr��e aufgrund eines Konzentrationsgradienten zwischen Erythrozyten und Plasma. 

     

  • St�rung der chemischen Reaktion einer Methode durch eine aus Blutzellen freigesetzte Substanz. So st�rt die Peroxidaseaktivit�t von H�moglobin die Bilirubinbestimmung und freigesetzte Adenylatkinase die Bestimmung der CK. 

     

  • Optische Interferenz durch Ver�nderung des molaren Extinktionskoeffizienten des zu messenden Substrates oder Produktes der Analysenreaktion durch H�moglobin. H�moglobin absorbiert stark Licht bei 415 nm (Soret-Bande). H�molyse addiert Absorption und bewirkt eine scheinbare Erh�hung der gemessenen Konzentration.

Die St�rung klinisch-chemischer Tests durch H�molyse ist vielfach publiziert worden /12�14/. Eine Auflistung h�ufig gest�rter Me�gr��en zeigt Tab. 5.

Tab. 5: St�rungen von Me�gr��en bzw. Methoden durch H�molyse

Me�gr��e/Methode
HinweisAspartataminotransferase (AST)

Die Aktivit�t der AST im Erythrozyten ist 40mal h�her als im Plasma. Bei Serumaktivit�ten im Entscheidungsbereich verursacht eine in vitro-H�molyse von 1,5 g/l falsch hohe Werte durch AST-Addition/12/.

Bilirubin

Zu niedrige Konzentrationen werden mit der Jendrassik-Gr�f-Methode gemessen, da die Pseudoperoxidaseaktivit�t von H�moglobin die Diazofarbstoffbildung hemmt. Die Hemmung tritt auf, wenn die freie H�moglobinkonzentration im Serum h�her als 0,8 g/l ist /12/.

Creatinkinase (CK)

Aus Erythrozyten freigesetzte Adenylatkinase erh�ht die enzymatisch gemessene CK- und CK-MBAktivit�t. Die zum Reaktionsgemisch addierte Adenylatkinase kann nicht mehr durch vorhandenesAMP und Diadenosinpentaphosphat gehemmt werden. Es resultiert eine Erh�hung des Me�signals.

Eisen

Potentiell ist H�moglobin eine gro�e Quelle f�r Eisen. Da aber die Eisen-Porphyrinbindung st�rker als die Eisen-Transferrinbindung ist und die Eisenbestimmungsmethoden das Transferrin-gebundene Eisen messen, ist der additive Eiseneffekt bei H�molyse gering /14/.

Gesamteiwei�

Der additive Effekt von H�moglobin zum Gesamteiwei� ist zwar gering, aber signifikant.

Harns�ure

Erst hohe H�moglobinkonzentrationen bewirken erniedrigte Serumwerte. Die Uricase-Katalase-Methode (Kageyama-Reaktion) ist st�ranf�lliger als die Uricase-Peroxidase-Methode (Trinder- Reaktion).

Kalium

Die Kaliumkonzentration im Erythrozyten ist etwa 25mal h�her als im Plasma. Auch bei durch Rotf�rbung nicht sichtbarer in vitro-H�molyse (< 0,3 g freies H�moglobin/l) steigt die Kaliumkonzentration an. Das ist z. B. der Fall bei mehrst�ndigem Stehen von Vollblut mit niedrigen Glucosewerten bei Raumtemperatur.

Anorganisches Phosphat

Blutzellen haben einen hohen Phosphorgehalt, der aber organisch als Ester gebunden ist. Die Addition organischer Phosphatester zum Serum kann dort zu einer Freisetzung von anorganischem Phosphat f�hren, woraus falsch hohe Phosphatkonzentrationen resultieren k�nnen. Serum sollte deshalb innerhalb von 2 h von den Erythrozyten getrennt werden.

Serumeiwei�- Elektrophorese

H�moglobin-Haptoglobin-Komplexe wandern zwischen der �2- und �-Globulinfraktion, freies H�moglobin als diffuse r�tliche Bande in der �-Globulinfraktion.

Immunoassays

Wie die Me�gr��en der klinischen Chemie sind auch Immunoassays von den Diagnostikaherstellernauf St�rungen durch H�molyse gepr�ft und enthalten entsprechende Angaben. Nicht selten erfolgt die Pr�fung auf den St�rfaktor H�molyse nur durch die Zugabe von H�moglobin, meist wird humanes Meth�moglobin verwendet. Bei vermuteter St�rung eines Immunoassays durch H�molyse darf jedoch nicht H�moglobin mit H�molyse gleichgesetzt werden, da au�er H�moglobin auch andere Inhaltsstoffe von Blutzellen den Immunoassay st�ren k�nnen. Es ist deshalb wichtig, beim Diagnostikahersteller nachzufragen wie die Pr�fung auf H�molyse erfolgte

Literatur

  1. Guder W. Haemolysis as an influence and interference factor in clinical chemistry. J Clin Chem Clin Biochem 1986; 24: 125�6.
  2. Guder W. Einflu�gr��en und St�rfaktoren bei klinisch-chemischen Untersuchungen. Internist 1980; 21: 533�42.
  3. Guder W, Fonseca-Wollheim F, Heil W, Schmitt M, T�pfer G, Wisser H, Zawta B. Die h�molytische, ikterische und lip�mische Probe. Empfehlungen zur Erkennung und Vermeidung klinisch relevanter St�rungen.DG Klinische Chemie-Mitteilungen 1999; 30: 167�77.
  4. Carraro P, Servidio P, Plebani M. Hemolyzed specimens: a reason for rejection or clinical challenge? Clin Chem 2000; 46: 306�7.
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  11. Druml W, Grimm G, Laggner AN, Schneewei� B, Lenz K. Hyperlipidemia in acute hemolysis. Klin Wochenschr 1991; 69: 426�9.
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