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Haemolysis as influence and interference factor espa ol

  
Hemolisis como influencia y factor de interferencia

Prof. Dr. L. Thomas, Kirschbaumweg 8, 60489 Frankfurt, Deutschland
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Introducci�n

La hem�lisis es un importante factor de interferencia para los resultados del laboratorio, por lo que este efecto no deber�a  olvidarse. A causa de la mecanizaci�n anal�tica y al incremento de la automatizaci�n de la fase pre-anal�tica de los laboratorios, el examen de las muestras hemolizadas es a menudo insuficiente. Debido a la concentraci�n de laboratorios las muestras de sangre sufren largos desplazamientos. Como consecuencia se produce un incremento de las muestras hemol�zadas, y a pesar de que �sta hem�lisis pueda no ser, en muchas ocasiones, apreciada visualmente, puede haberseproducido una descarga de los componentes intracelulares al plasma.Si hay muestras de pacientes con s�ndrome hemol�tico (hemolisis in vivo), la separaci�n de la hem�lisis in vitro, en general debido a una inapropiada extracci�n de sangre, rara vez es posible.

Las consecuencias son, a menudo, resultados err�neos en el an�lisis. Estas variaciones pueden ser muy altas o por elcontrario muy bajas o tambi�n sorprendentes resultados patol�gicos, por ejemplo en la medida de las concentraciones de ion potasio, lactato-deshidrogenasalactato-deshidrogenasa, aspartato-aminotransferasaaspartato-aminotransferasa, fostatasa �cida, g,g-fosfopiruvato-hidratasa (enolasa espec�fica de neurona).

El objetivo de este estudio es precisar el alcance de la interferencia producida por la hemolisis en los resultados de laboratorio y la disminuci�n de extracciones erroneas desangre.

Hem�lisis

La hem�lisis es la liberaci�n de los componentes intracelulares de eritrocitos, trombocitos y leucocitos en el l�quido extracelular, ej.dentro del plasma o suero /1/. La hem�lisis es visible despu�s de la centrifugaci�n de la muestra; plasma o suero, muestran una coloraci�n roja. La especificaci�n, en el estudio, se encuentra en la concentraci�n de hemoglobina libre, la cual viene  indicada por una coloraci�n roja en el plasma/suero que var�a entre 100 y 300mg/l.

La hem�lisis puede dar alteraciones en magnitudes espec�ficas de la muestra a analizar. Es un factor biol�gico que influye si la liberaci�n de constituyentes de c�lulas sangu�neas tuvo lugarin vivo. La hem�lisis es un factor de  interferencia, si �sta tiene lugar despu�s de la recolecci�n de la muestra, esto puede producir cambios en los resultados./ 2/

La lisis de trombocitos y granulocitos tambi�n puede influir en los resultados a pesar de que la hem�lisis no sea visible /3/. Si observamos minuciosamente el proceso de coagulaci�n, la trombocitolisis es la responsable de la alta concentraci�n de componentes intracelulares en el suero en oposici�n a la del plasma. Una degradaci�n intravasal de leucocitos puede conducir, por ej.: concentraciones elevadas de lisozima en leucemias mieloides y monociticas.

Causas de hem�lisis

Si observamos, en la fase preanal�tica,el centrifugado de las muestras sangu�neas, la hem�lisis representa el 60 % de las causas de rechazo de las muestras. En un estudio  /4/ el 3,3 % de las muestras que fueron enviados al laboratorio cl�nico presentaron hem�lisis. Cuando se comprob� la causa, s�lo el 3,2% de in vivolas hem�lisis se produjeron in vivo.

Hem�lisis in vitro

Durante la toma de mustras se pueden producir incorrecciones que conduce a hem�lisis in vivo (Tabla 1). En la tabla 2 se exponen con detalle nuevas posibilidades de incorrecciones.

 

 Tabla 1: Hem�lisis mas frecuente mientras se efect�a la recogida de muestras en sangre

  • Aspiraci�n intensa, particularmente durante la punci�n superficial de las venas. La aspiraci�n por medio de agujas finas suele causar menos hem�lisis que con agujas gruesas. Sin embargo el flujo de corriente es m�s bajo y la velocidad de fluido, turbulencia y hem�lisis se supone que son menores. /5/

  • la obstrucci�n parcial de un cat�ter venoso o arterial. La consecuencia es una aspiraci�n m�s intensa si la muestra es extraida con una jeringa.

  • Extracci�n con una jeringa y despu�s repartir alicuotas en varios tubos de ensayo.

Tabla 2: Causas de hem�lisis despu�s de la recogida de muestras de sangre

  • agitaci�n de la sangre vigorosamente

  • centrifugaci�n de la sangre antes de la completa coagulaci�n 

     

  • centrifugaci�n de muestras parcialmente coaguladas procedentes de pacientes con medicaci�n de anticoagulantes

  • presi�n positiva o negativa en los tubos de muestra

  • diluci�n de la sangre con soluci�n hipot�nica

  • congelaci�n y descongelaci�n de la sangre

  • almacenamiento o transporte de sangre  durante varios dias a temperatura ambiente

Hem�lisis in vivo

La hem�lisis in vivo est� provocada preferentemente por medio de anticuerpos, bioqu�micamente a trav�s de medicamentos, sustancias t�xicas, herencia (por ej. hemoglobinopatia, defectos enzim�ticos, ictericia) o infecciones (por ej. malaria). Si se sospecha una hem�lisis in vivo se deber� examinar el plasma para excluir una hemolisis in vitro a�adida /1/ causado por un proceso de la cogulaci�n.

Detecci�n de la hem�lisis

La hem�lisis es visible en muestras no ictericas. Una coloraci�n roja en el suero y en el plasma es apreciada si la concentraci�n de hemoglobina libre esta por encima de 300 mg/l. La medici�n de la concentraci�n de hemoglobina libre por debajo de este valor se hace por inmunofelometria /7/ o espectrometria usando doble longitud de onda (por.ej. ACA). El limite superior para plasma es 20 mg/l, para suero 50 mg/l.

Cambios en el plasma/suero debidos a la hem�lisis

La hem�lisis in vivo o in vitro, con la consiguiente liberaci�n de sustancias de las c�lulas sangu�neas, donde la concentraci�n intracelular es 10 veces mayor que en el medio extracelular, puede incrementar los resultados de plasma y suero significativamente . Particularmente en lo corcerniente a ion potasio, lactato-deshidrogenasa y aspartato-aminotransferasa. Las sustancias cuyas concentraciones son m�s altas en suero que en plasma proceden de los trombocitos, por.ej. potasio, g,g-fosfopiruvato-hidratasa, fosfatasa �cida. Los indicadores de una hem�lisis est�n expuestos en la tabla 3. 

Tabla 3: Indicadores de hem�lisis

  • coloraci�n roja del plasma o suero

  • imprevisto incremento en potasio, lactato-deshidrogenasa, aspartato-aminotransferasa, fosfatasa �cida, enolasa g,g-fosofpiruvato-hidratasa

  • disminuci�n de la concentraci�n de haptoglobina

  • subida de bilirrubina no esterificada

  • aumento del �ndice de reticulocitos

Diferenciaci�n de la hem�lisis in vivo e in vitro

A�n cuando la hem�lisis in vitro es m�s frecuente que la in vivo, �sta �ltima tiene una importancia cl�nica mayor debido a su origen patol�gico y porque los par�metros, influidos por hemolisis, son importantes para el diagn�stico, seguimiento y monitorizaci�n terapeutica de las enfermedades. En caso de diagnosticar hem�lisis in vivo no tiene ning�n sentido rechazar una muestra. Por esta raz�n se ha de efectuar una diferenciaci�n del tipo de hem�lisis (in vitro, in vivo).

La hemoglobina liberada in vivo, esta unida a la haptoglobina y transportada preferentemente al bazo hacia el sistema reticuloendotelial. La hemoglobina libre es s�lo cuantificable en plasma si la capacidad de transporte esta en su l�mite. Por ello la haptoglobina no es cuantificable por m�todos inmunonefelometricos o inmunoturbidimetricos. Pueden cuantificarse concentraciones de haptoglobina dentro del margen de referencia aunque al mismo tiempo haya una respuesta de fase aguda (aumento de CRP) en pacientes con hiperesplenismo. Aumentos de la concentraci�n de haptoglobina y de hemoglobina libre es constatado en pacientes con plasmocitoma. /8/

En el s�ndrome de HELLP la concentraci�n haptoglobina del plasma puede ser normal durante el diagn�stico, sin embargo disminuir� en los diez d�as siguientes./10/

Cuando se sospecha un s�ndrome hemol�tico, el descenso de haptoglobina y el aumento en lactato-deshidrogenasa, bilirrubina indirecta no esterificada e �ndice de reticulocitos depender�n del grado de hem�lisis. Para estados de hem�lisis avanzada, cambios en lactato-deshidrogenasa, bilirrubina no esterificada y haptoglobina pueden ocurrir durante las 24 horas siguientes, sin embargo, un aumento del �ndice de reticulocitos ocurre como muy pronto 2 d�as m�s tarde. Un aumento de la bilirrubina no esterificada puede ser cuantificable solo si la tasa de hem�lisis que normalmente es 0,8 %, sube por encima del 5 %. Un aumento de lactato-deshidrogenasa en hem�lisis intravasal es s�lo medidada, si el �ndice de recticulocitos est� por debajo del 10 %. En un sujeto con una actividad de lactato-deshidrogenasa de 165 U/l, una hemolisis in vtro de 800 mg de hemoglobina en suero, causa un 58% de aumento en la actividad de lactato-deshidrogenasa./10/. Una hem�lisis intravasal masiva con una disminuci�n del hematocrito de m�s de una cuarta parte en 12 horas, puede causar una hipertrigliceridemia. Las causas pueden ser un reducido metabolismo de triglic�ridos causado por una disminuci�n de micro-circulaci�n o movilizaci�n de �cidos grasos libres y su re-esterificaci�n a trigliceridos. /11/.En la tabla 4 se exponen los criterios para distinguir la hem�lisis in vitro e in vivo.

Tabla 4: Diferentes tipos de hem�lisis 

Hem�lisis in vitro

  • Incremento paralelo de las concentraciones de hemoglobina (coloraci�n roja del plasma/suero), ion potasio, lactato-deshidrogenasa, aspartato-aminotransferasa, sin embargo las concentraciones de haptoglobina y de reticulocitos se mantienen dentro de los intervalos fisiol�gicos.

  • Aumento imprevisto de la concentraci�n de ion potasio, pero no se da la coloraci�n roja en el plasma/suero, lactato-deshidrogenasa en el intervalo fisiol�gico. Ej: si toda la sangre es almacenada varios dias. 

     

Hem�lisisin vitro

  • Incremento paralelo de la concentraci�n de hemoglobina (coloraci�n roja del plasma/suero) y lactato-deshidrogenasa pero no se da un aumento paralelo en la concentraci�n de ion potasio.

  • No hay coloraci�n roja del plasma, pero hay un descenso de la concentraci�n de haptoglobina y un incremento potencial de las concentraciones lactato-deshidrogenasa, bilirrubina  o de reticulocitos. 

     

  • Suero/plasma sin coloraci�n roja, pero incremento en lactato-deshidrogenasa, potasio, fosfatasa �cida. No se da un moderado incremento en las unidades de medida en plasma (esto se ha advertido en el estado de la trombocitosis).

Hem�lisis como factor de interferencia

La liberaci�n de sustancias de las c�lulas sangu�neas al plasma pueden producir cambios del valor  de algunas magnitudes por las siguientes razones:

  • Incremento o descenso de las concentraciones obtenidas debido al gradiente de concentraci�n entre los eritrocitos y el plasma.

  • Interferencia de la reacci�n qu�mica mientras se produce la liberaci�n de sustancias de las c�lulas sangu�neas (la actividad seudoperoxid�sica de la hemoglobina interfiere la medici�n de la concentraci�n de bilirrubina y  la liberaci�n de adenilato-cinasa interfiere la medici�n de la concentraci�n de de creatina-cinasa, por ejemplo). 

     

  • La hemoglobina en una muestra puede interferir con la reacci�n qu�mica, porque cambia los coeficientes de absorci�n molar del substrato o de los productos de reacci�n que deber ser  medidos. La hemoglobina absorbe vigorosamente luz a 415 nm. La hem�lisis aumenta la absorci�n y causa aparentemente un incremento de la concentraci�n medida.

Existen numerosas publicaciones sobre las interferencias casusadas por la hemoglobina en los an�lisis qu�mic-cl�nicos.. /12-14/. En la tabla 5 se expone una relaci�n de las magnitudes frecuentemente interferidas por la hem�lisis.

Tabla 5:  Interferencias  en las magnitudes y los m�todos.

Magnitud, m�todosComentariosAspartominotransferasa AST

La actividad catal�tica de aspartato-aminotransferasa en los eritrocitos es 40 veces mayor que en el plasma.. En sujetos con una concentraci�n de aspartato-aminotransferasa en el intervalo fisiol�gico, una hemolisis con una concentraci�n de hemoglobina de 1,5 g/l provoca una aumento de la concentraci�n de aspartato-aminotransferasa en el plasma

Bilirrubina

Con el m�todo Jendrassik-Gr�f se produce una disminuci�n de la concentraci�n debido a que la actividad seudoperoxid�sica impide la formaci�n de la formaci�n del diazo-compuesto coloreado. Esta reacci�n puede producirse si la concentraci�n de hemoglobina en el plasma es mayor de 0,8 g/l. /12/

Creatina-cinasa

La liberaci�n de la adenilato-cinasa de los eritrocitos incrementa la concentraci�n catal�tica de creatina-cinasa y de su isoenzima M. La adenilato-cinasa a�adida a la mezcla de la reacci�n qu�mica no puede ser inhibido por el AMP y el diadenosinpetafosfato. El resultado es un incremento de la se�al medida.

Hierro

Potencialmente la hemoglobina es un gran fuente de hierro. Sin embargo, el efecto aditivo del hierro es insuficiente porque la uni�n hierro-porfirina es m�s intensa que la uni�n hierro-transferrina y los m�todos de medida de la concentraci�n de hierro s�lo miden el hierro procedente de la transferrina.

Proteina 

El efecto aditivo de la hemoglobina aa la totalidad de proteina  es peque�o, pero significativo.

Urato

S�lo las altas concentraciones de hemoglobina causan una disminuci�n de la concentraci�n de urato en el plasma. El m�todo de la uricasa-catalase (reacci�n Kageyama) es m�s susceptible a esta interferencaia que el m�todo de la peroxidasa.

Ion potasio

La concentraci�n de ion potasio en los eritrocitos es aproximadamente 25 veces mayor que en el plasma. La concentraci�n de ion potasio se eleva, a pesar de que el color rojo propio de la hem�lisis in vitro no es visible. Esto puede producirse si una muestra de sangre con una concentraci�n de glucosa baja se almacena varias horas a temperatura ambiente.

Fosfato

Las c�lulas sanguineas tienen una proporci�n alta de fosfato, del cual la mayor parte es org�nico. La adici�n de �steres de fosfato alplasma puede producir una liberaci�n de fosfato inorg�nico, y la consecuencia puede ser una concentraci�n muy alta de fosfato, que es err�nea. Por esta raz�n el suero/plasma deber�a desprenderse de los eritrocitos en dos horas.

Electroforesis de las proteinas s�ricas

Los complejos hemoglobina-haptoglobina migran entre las fracciones a2 y b globulinas, la hemoglobina libre se aprecia como una banda difusa en la fracci�n b.

Inmuensayos

El estudio de la interferencia por la hem�lisis para los procedimientos inmunoqu�micos  los fabricantes de productos diagn�sticos lo realizan de forma comparable al resto de procediminetos de medida qu�mico-cl�nicos. No obstante, para estos estudios los fabricantes a menudo s�lo a�aden hemoglobina a las muestras, principalmente se utiliza metahemoglobina humana. Debe diferenciarse la interferencia causada por la hemoglobina de la causada por la hem�lisis, ya que las c�lulas sangu�neas contienen tambi�n otros productos, adem�s de hemoglobina, que pueden afectar el procedimiento inmunoqu�mico. Por lo tanto es muy importante preguntar al fabricante c�mo han sido realizados estos estudios. 

 

Literatura:

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